אנולה הולמס (מילי בובי בראון) פותחת סוכנות בלשית משלה בלונדון, ומגלה במהרה שלהיות בלשית זה לא פשוט כפי שחשב. כשהיא מקבלת את תפקידה הראשון – למצוא נערה נעדרת שהציעה לה ילדת מכירת גפרורים – היא נחשפת לעולם אפל ומסוכן שמסתתר מאחורי מסכי התיאטראות הצבעוניים ומפעלים קודרים. החקירה מובילה אותה אל קונספירציה מסוכנת שמשלבת בין שכבות החברה הגבוהה לבין הפועלים במפעלים, והיא נאלצת לנווט בין עולמות מנוגדים ולפעמים עוינים. במהלך החקירה אנולה פוגשת דמויות שונות, חלקן עוזרות לה, וחלקן מנסות לסכל את מאמציה. בין היתר היא פונה לעזרתו של אחיה המפורסם, שרלוק הולמס (הנרי קאוויל), שמסייע לה להבין את הקשרים המורכבים של התעלומה. היא גם מסתמכת על חבריה הקרובים, שמעניקים לה תמיכה וידע חשובים. ככל שהיא מתקדמת, היא לומדת שהמשימה שלה גדולה בהרבה ממה שדמיינה, והסכנה שמאיימת על הנערה הנעדרת ועל החברה כולה מחייבת אותה לחשוב במהירות ולפעול בנחישות. אנולה הולמס 2 מציגה את המסע של נערה צעירה שמנסה להוכיח את עצמה בעולם שדורש ממנה להילחם על מקומה, תוך כדי גילוי כוחותיה ויכולותיה הבלשיות. החקירה המורכבת חושפת סודות אפלים ומערכות יחסים מורכבות, וההצלחה תלויה ביכולתה של אנולה לשלב בין אינטואיציה, אומץ וחשיבה יצירתית כדי לחשוף את האמת ולהציל את הנעדרת. במהלך החקירה אנולה מתמודדת עם אתגרים לא צפויים, בין היתר נאלצת להתמודד עם פערים חברתיים ועם סכנות פיזיות שמאיימות עליה. היא מגלה כי ישנם כוחות רבי עוצמה המעורבים בפרשה, ונאלצת להסתמך על תושייה ותחבולות כדי להתגבר עליהם. בסופו של דבר, הצלחתה בפתרון התעלומה מחזקת את מעמדה כבלשית צעירה ומוכשרת, ומבססת את סוכנות הבלשית שלה כלגיטימית ומוערכת. הסרט מדגיש את חשיבות העצמאות, האומץ ואת היכולת להתמודד עם מציאות מורכבת, ומציג את אנולה כדמות מעוררת השראה שמצליחה לפרוץ גבולות ולהתמודד עם עולם שמנסה להגביל אותה.
