לארי דיילי (בן סטילר) הוא אב גרוש שמתקשה לשמור על עבודה יציבה. מתוך צורך לפרנס את משפחתו, הוא מקבל משרה כשומר לילה במוזיאון להיסטוריה טבעית. אך מהר מאוד מתברר שלארי מחכה שם אתגר יוצא דופן: תערוכות המוזיאון, שנושאות קללה עתיקה, מתעוררות לחיים עם רדת החשיכה. במהלך הלילה, דמויות היסטוריות, חיות פרהיסטוריות ואובייקטים עתיקים יוצאים משליטתם וגורמים למהומה גדולה. לארי מוצא עצמו נאבק לבלום את הכאוס שנוצר, כשהוא מנסה להבין כיצד לשלוט על היצורים החיים שמסתובבים במוזיאון. בין הדמויות המיוחדות שמלוות אותו בלילה נמצא דמותו המוזהבת של תיאודור רוזוולט (רובין ויליאמס), שעוזרת לו להתמודד עם המצב המוזר. בעזרתו של רוזוולט, לצד כישרונו האישי ונחישותו, מצליח לארי להחזיק את המוזיאון תחת שליטה ולמנוע אסונות. הסרט מתמקד במאבקו של לארי לשלב בין חייו האישיים המורכבים לבין האחריות המפתיעה שנפלה עליו בלילות במוזיאון. הוא לומד להכיר את עצמו מחדש, לפתח אומץ ולמצוא דרכים יצירתיות להתמודד עם האתגרים הבלתי צפויים. במקביל, לארי מנסה להוכיח לעצמו ולבני משפחתו שהוא מסוגל להצליח, גם כשכל הסיכויים נגדו. הלילה במוזיאון הופך עבורו למסע של גילוי עצמי, אחריות ותקווה, כשהוא נאבק לשמור על הסדר בעולם שבו ההיסטוריה מתעוררת לחיים. לארי מגלה שהקללה העתיקה קשורה לאבן קסומה שמעניקה חיים לתערוכות. עם הזמן, הוא לומד כיצד להשתמש באבן כדי לשלוט ביצורים ולהחזירם למצבם הרגיל עם בוקר. לצד זאת, לארי יוצר קשרים מיוחדים עם הדמויות ההיסטוריות והחיות, שלומדות להעריך אותו ולסייע לו. במהלך הסרט, מתגלה כי המוזיאון הוא לא רק מקום עבודה, אלא גם בית שני עבור לארי, שמצליח למצוא בו משמעות חדשה לחייו. בסופו של דבר, לארי מצליח לשלב את תפקידו כשומר לילה עם חייו האישיים, כשהוא מראה לבני משפחתו שהוא אדם אחראי ואמיץ. הסרט משלב הומור, הרפתקאות וקסם, ומדגיש את החשיבות של אמונה בעצמך, אומץ לב ועבודת צוות. "לילה מוטרף במוזיאון" הפך לסרט משפחתי אהוב, שהוביל להמשכים וסדרת טלוויזיה, וזכה להצלחה רבה בקרב קהלים בכל הגילים.
