פיטר פארקר (טובי מגווייר) הוא תלמיד תיכון רגיל שמגלה לפתע שכל חייו עומדים להשתנות לאחר שנעקץ על ידי עכביש רדיואקטיבי. בעקבות העקיצה, פיטר מפתח כוחות על-אנושיים: הוא מסוגל לטפס על קירות ותקרות, לשגר קורים דביקים מפרקי ידיו ולחוש סכנות לפני שהן מתרחשות. כשהוא מתחיל להשתמש בכוחותיו, חייו מתמלאים באתגרים חדשים, במיוחד אחרי שדודו, מיי פארקר (רוסמרי האריס), נהרג באירוע טראגי שפיטר מרגיש אחראי לו. הוא נשבע לנקום את מותו ולהגן על העיר ניו יורק מפני איומים.
במקביל, פיטר מנסה לשלב בין חייו האישיים, מערכת היחסים המתפתחת עם מרי ג'יין ווטסון (קירסטן דנסט), והעבודה החדשה שלו, לבין האיום המתמיד של נורמן אוסבורן (וילם דפו), אביו של חברו הטוב הארי אוסבורן (ג'יימס פרנקו). נורמן הופך להיות הגובלין הירוק, אויב מסוכן שמאיים להפוך את חיי פיטר לסיוט. הקרב בין ספיידרמן לפושע המסתורי מתעצם, כאשר פיטר נאלץ להתמודד עם האמת הכואבת על נורמן ועל הקשר המשפחתי המורכב עם הארי. בעודו נאבק לשמור על סוד זהותו ולשמור על האנשים שהוא אוהב, ספיידרמן / פיטר פארקר (טובי מגווייר) מבין שהכוחות החדשים שלו מביאים לא רק יכולות מדהימות אלא גם אחריות כבדה, והמאבק נגד הגובלין הירוק הוא מבחן אמיתי לאומץ ולנחישות שלו. בנוסף, פיטר מתמודד עם הקושי לשמור על זהותו הסודית מפני חבריו ובני משפחתו, במיוחד מיי פארקר, שממשיכה לתמוך בו למרות הסכנות. במהלך הסרט, פיטר לומד שיעורים חשובים על כוח, אחריות והקרבה אישית. הקונפליקט עם הגובלין הירוק מגיע לשיאו בקרב מרהיב שבו פיטר חייב להשתמש בכל כישוריו כדי להציל את העיר ולהגן על האנשים הקרובים אליו. בסופו של דבר, הוא מקבל את תפקידו כספיידרמן במלואו, כשהוא מבין שהגיבורים אינם מושלמים, אך הם מוכנים להילחם למען הצדק בכל מחיר. הסרט מדגיש את המסר שעם כוח גדול מגיעה אחריות גדולה, ומציג את פיטר פארקר כגיבור שמסוגל לאזן בין חייו האישיים לבין תפקידו המורכב כמגן העיר.
