פיטר פארקר (טובי מגווייר) מתמודד עם המשבר האישי והזהותי שמלווה אותו מאז שקיבל את כוחות העל שלו כספיידרמן. הכוחות המיוחדים, שבראשם עומדת היכולת לטפס על קירות ולירות קורים, הופכים לנטל שמקשה עליו לנהל חיים רגילים ולשמור על קשרים חברתיים, במיוחד עם מרי ג'יין (קירסטן דנסט), אהובתו. פיטר נאבק בין הרצון להגן על העיר ולמלא את תפקידו כגיבור לבין הצורך למצוא איזון בין חייו הפרטיים והאחריות העצומה שמונחת על כתפיו. במקביל, דוקטור אוטו אוקטביוס (אלפרד מולינה), מדען מבריק שהפך לנבל עם זרועות רובוטיות חכמות המחוברות לגופו, מהווה איום מסוכן על ניו יורק ועל פיטר עצמו. אוקטביוס, שנכשל בניסוי מדעי שהוביל לפציעתו, הופך לדמות מורכבת שמאזנת בין רצון לתקן את טעויות העבר לבין הכוח ההרסני שהזרועות הענקיות מעניקות לו. המאבק בין פיטר לאוקטביוס מתפתח לסדרת קרבות עזים ומותחים, שמעמידים את גבולות כוחו הפיזי והנפשי של ספיידרמן למבחן.
הסרט מעמיק בנושאים של אחריות, קורבנות וחששות פנימיים, ומציג את פיטר פארקר לא רק כגיבור על, אלא כאדם שמתמודד עם שאלות של זהות, אהבה וייעוד. חברו הטוב של פיטר, הארי אוסבורן (ג'יימס פרנקו), מתמודד עם האובדן של אביו, מה שמוסיף עומק רגשי לסיפור ומסבך את מערכות היחסים בין הדמויות. "ספיידרמן 2" מצליח לשלב אקשן מרהיב עם דרמה אנושית, ומציג את פיטר פארקר במאבק לא פשוט שמכתיב את עתידו והאם יוכל לשמור על האנושיות שלו בתוך כל הכאוס.
